Endothel-abgeleitetes C-Typ-natriuretisches Peptid wirkt der Pathogenese der pul

Endothel-abgeleitetes C-Typ-natriuretisches Peptid wirkt der Pathogenese der pulmonalen Hypertonie entgegen AbstraktIm systemischen Kreislauf erfüllt das C-Typ-natriuretische Peptid (CNP) eine multimodale homöostatische Funktion und moduliert viele für die pulmonale Hypertonie (PH) relevante Prozesse, darunter den lokalen Blutfluss, die Gefäßumgestaltung und die Herzfunktion. Wir haben eine parallele, schützende Rolle von CNP im Lungenkreislauf und der rechten Herzkammer erforscht und das Potenzial der Ausnutzung der Signalgebung des natriuretischen Peptidrezeptors (NPR) im Zusammenhang mit PH untersucht. Die Entwicklung von PH wurde bei Wildtyp- (WT), Endothel-restringierten (ecCNP -/- ) und Kardiomyozyten-spezifischen (cmCNP -/- ) CNP-Knockout-Mäusen sowie bei globalen NPR-C-Tieren (NPR-C -/- ) untersucht, die 5 Wochen lang Hypoxie (10 % O 2 ) und dem Antagonisten des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptors Sugen (SuHx) ausgesetzt waren. Um das therapeutische Potenzial der NPR-Signalgebung zu untersuchen, wurde exogenes CNP mittels einer subkutanen osmotischen Minipumpe an Tiere mit etablierter PH verabreicht. Die Entwicklung von PH, einschließlich rechtsventrikulärem systolischem Druck (RVSP), rechtsventrikulärer Hypertrophie (RVH) und RV-Fibrose, war bei ecCNP -/- Mäusen, die SuHx ausgesetzt waren, verstärkt, während die globale Deletion von NPR-C die Entwicklung von RVH und Fibrose spezifisch verschlimmerte, ohne den RVSP zu verändern. Im Gegensatz dazu führte der Verlust von aus Kardiomyozyten stammendem CNP nicht zu einem signifikanten negativen Phänotyp. Die pharmakologische CNP-Gabe reduzierte den RVSP signifikant und förderte die antiproliferative, anti-remodeling-Signalgebung im kardiopulmonalen Kreislauf. Diese Daten verdeutlichen die schützende Rolle der endogenen CNP-Signalgebung gegen die Entwicklung von PH und liefern vorläufige Beweise für das therapeutische Potenzial der gezielten Behandlung CNP-abhängiger Signalwege, einschließlich der beiden verwandten NPR-B und NPR-C, im Zusammenhang mit Lungengefäßerkrankungen und RV-Umbau.Grafische Zusammenfassung

1. Download: Bild mit hoher Auflösung herunterladen (199 KB)
2. Download: Bild in voller Größe herunterladen

• Vorheriger Artikel in der Ausgabe
• Nächster Artikel in der Ausgabe

SchlüsselwörterNatriuretisches PeptidNatriuretischer PeptidrezeptorPulmonale HypertonieGefäßumbauRechtsventrikuläre Fibrose1. Einleitung​Pulmonale Hypertonie (PH) ist eine vielschichtige Erkrankung, die durch Gefäßumbau und erhöhten Lungendruck gekennzeichnet ist  [1]  . Obwohl gezielte pharmakologische und chirurgische Interventionen die Ergebnisse bei einigen PH-Untergruppen deutlich verbessern, entwickeln die meisten Patienten dennoch eine tödliche Rechtsherzinsuffizienz; die 5-Jahres-Mortalität liegt weiterhin bei nahezu 50 %  [2]  .Im systemischen Kreislauf reguliert das C-Typ natriuretische Peptid (CNP) den Gefäßtonus, die Angiogenese, Entzündungen, die Proliferation glatter Muskeln und Endothelzellen, die Hypertrophie von Kardiomyozyten und die Herzfibrose  [3]  ,  [4]  ,  [5]  . Diese multimodale homöostatische Rolle wird von zwei Zelloberflächenrezeptoren erfüllt: dem natriuretischen Peptidrezeptor (NPR)-B, der partikuläre Guanylylcyclase-gekoppelt ist  [6]  , und NPR-C, der an G-Proteine ​​koppelt, um intrazelluläre Signale auszulösen  [7]  und auch eine aktive Rolle bei der Clearance des natriuretischen Peptids zu spielen scheint  [8]  . Indirekte Hinweise legen nahe, dass diese CNP-Signalwege eine parallele, schützende Wirkung im Lungenkreislauf ausüben könnten, wenn auch vordergründig aus pharmakologischer Sicht. So verhindert beispielsweise die Infusion von CNP die durch Monocrotalin induzierte PH und die durch Bleomycin induzierte Lungenfibrose  [9]  [10]  ( obwohl sie in einem auf Hypoxie basierenden experimentellen Modell nicht wirksam ist  [11]  ) und verringert den hyperproliferativen Phänotyp in Perizyten von Patienten mit PAH  [12]  , während die gezielte Aktivierung von NPR-C den pulmonalarteriellen Druck senkt  [13] . Darüber hinaus werden die positiven Effekte von Phosphodiesterase (PDE)-5-Hemmern bei experimenteller PH durch die gleichzeitige Verabreichung von Inhibitoren der neutralen Endopeptidase (NEP)  [14]  , eines Enzyms, das natriuretische Peptide abbaut, verstärkt . Dieses Phänomen ist auch bei PAH-Patienten erkennbar; in einer randomisierten, doppelblinden, placebokontrollierten Phase-IIa-Studie zeigte der NEP-Hemmer Racecadotril eine synergetische Wirkung mit einer Hintergrundtherapie mit einem PDE5-Hemmer zur Erhöhung der Plasmaspiegel des natriuretischen Peptids, wodurch eine stärkere PVR-Senkung erreicht wurde als durch PDE5-Hemmung allein  [15]  . Da CNP das NP ist, das am anfälligsten für NEP-Abbau ist, deuten diese Berichte darauf hin, dass die endogene CNP-Signalgebung entscheidend für die Dämpfung der PH-Pathogenese und eine potenzielle Behandlung dieser Erkrankung sein könnte. Es gibt auch Assoziationen zwischen zirkulierenden CNP-Werten und/oder seinem N-terminalen Fragment NT-proCNP in PH-Modellen und Patienten mit dieser Erkrankung, der Pulmonalarteriendruck ist ein unabhängiger Prädiktor der zirkulierenden CNP-Werte und NPR-B und NPR-C werden im rechten Ventrikel (RV) reichlich exprimiert  [16]  ,  [17]  ,  [18]  . Es wurde auch berichtet, dass NT-proCNP ein guter diagnostischer Indikator für die Schwere der Erkrankung bei Patienten mit PH in Verbindung mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD)  [19]  und für den rechten Vorhofdruck bei Patienten mit präkapillärer PH  [20]  ist .Trotz dieser Verbindungen zwischen CNP und kardiopulmonaler Funktion bei PH konnte bisher keine definitive Rolle der intrinsischen CNP-gesteuerten Signalgebung in der kardialen und vaskulären Struktur und Funktion im Zusammenhang mit PH nachgewiesen werden. Hierin untersuchten wir neuartige transgene Mausstämme mit zellbeschränkter Deletion von CNP und/oder globaler Deletion des verwandten NPR-C, um eine Rolle dieses Peptids bei der Entwicklung von experimenteller PH und RV-Hypertrophie (RVH) zu etablieren.2. Methoden​2.1 . Sugen plus Hypoxie-Modell der PHMäuse (männlich und weiblich, Alter 7–11 Wochen) erhielten Injektionen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor-2-Antagonisten Sugen 5416 (SU5416, Sugen; 3 × 20 mg/kg, sc, im Abstand von 7 Tagen; firmenintern synthetisiert) und wurden fünf Wochen lang in einer belüfteten Plexiglaskammer einer chronischen normobaren Hypoxie (10 % O 2 ; bezeichnet als SuHx) ausgesetzt, wie bereits zuvor beschrieben  [21]  . Der Versuchsleiter wurde, soweit möglich, über die Behandlung und/oder den Genotyp im Unklaren gelassen. Altersgleiche normoxische (NmOx) Kontrollmäuse wurden bei Raumluft (21 % O 2 ) gehalten und erhielten Vehikel (Carboxymethylcellulose, 0,5 % (w/v); Natriumchlorid 0,9 % (w/v); Polysorbat 80, 0,4 % (v/v); Benzylalkohol, 0,9 % (v/v; Sigma Aldrich, UK; in doppelt destilliertem Wasser). In einigen Studien wurden WT und NPR-C -/- SuHx CNP (0,2 mg/kg/Tag; sc) mittels einer osmotischen Minipumpe (Azlet, Modell 1002; Kalifornien, USA) verabreicht. Die Verabreichung begann 3 Wochen nach dem Einsetzen der Hypoxie und wurde für die restliche Zeit der Studie aufrechterhalten.2.2 Menschliche Zellen , Gewebeproben und ethische GenehmigungGlatte Muskelzellen der Pulmonalarterien (PASMC) wurden von Patienten mit idiopathischer pulmonaler arterieller Hypertonie oder von Erwachsenen, die sich einer Transplantation oder Lungenresektion wegen Verdachts auf eine maligne Erkrankung unterzogen, gewonnen (Kontrollen; ethische Genehmigung des Institute of Child Health und des Great Ormond Street Hospital REC 05/Q0508/45)  [22]  . RV-Biopsien von Patienten mit chronisch thromboembolischer pulmonaler Hypertonie (CTEPH) wurden vor und nach chirurgischer Thrombendarteriektomie isoliert und vom Ethikrat der Justus-Liebig-Universität Gießen genehmigt (AZ 44/14, 144/11, 145/11, 146/11 und 199/15)  [23]  . Alle Patienten gaben nach Aufklärung ihre schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie.2.3 Transgene MäuseEndotheliale (ecCNP –/– ) und Kardiomyozyten (cmCNP –/– )-restringierte CNP-Knockout-Mäuse (KO) wurden durch Kreuzung von Nppc LoxP-flankierten (CNP fl/fl ) mit einer Angiopoietin Tie 2 Rezeptor-gesteuerten Cre-Rekombinase bzw. einer α-MHC-gesteuerten Cre-Rekombinase erzeugt (siehe unsere früheren Veröffentlichungen zur Erzeugung transgener Stämme, zur Verifizierung der Gendeletion und zum kardiovaskulären Phänotyp  [3]  ,  [4]  ). Globale NPR-C KO-Mäuse (NPR-C –/– ) waren ein freundliches Geschenk von Prof. Oliver Smithies (University of North Carolina, USA)  [8]  . Wildtyp-Wurfgeschwister (WT) dienten durchgehend als Kontrollen. Alle Tierversuche wurden gemäß dem Animals (Scientific Procedures) Act des britischen Innenministeriums von 1986 durchgeführt, es wurden die ARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) sowie die EU-Empfehlungen (Richtlinie 2010/63/EU) für Versuchsplanung und -analyse in der pharmakologischen Versorgung eingehalten und sie wurden von einem lokalen Tierschutz- und Ethikausschuss (AWERB) an der QMUL genehmigt. Die Tiere wurden in einer temperaturkontrollierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Rhythmus untergebracht. Futter und Wasser waren ad libitum zugänglich . Für In-vivo -Experimente wurden die Tiere zufällig den Interventionen zugeteilt und der Experimentator wurde, soweit möglich, über die Behandlung und/oder den Genotyp im Unklaren gelassen.2.4 Echokardiographie​Herzmorphologie und -funktion wurden mit einem VisualSonics Vevo 3100-Echokardiographiesystem und einer MX550D-Sonde (Frequenz 32 – 55 MHz) beurteilt. Die Mäuse wurden anästhesiert (1,5 % Isofluran in O 2 ), und die Körpertemperatur wurde bei 37 °C gehalten. Die Pulmonalarterienbeschleunigungszeit (PAT), die RV-Auswurfzeit (RVET) und der Spitzenfluss in der Pulmonalarterie wurden anhand einer modifizierten linken parasternalen Längsachse mithilfe von gepulstem Doppler gemessen. Der diastolische freie RV-Wanddurchmesser (RVFWd) wurde anhand einer rechten parasternalen Längsachse im M-Modus bestimmt. Die systolische Exkursion der Trikuspidalanularebene (TAPSE) und der Spitzenfluss in der Trikuspidalklappe wurden anhand einer apikalen 4-Kammer-Ansicht mithilfe von M-Modus bzw. gepulstem Doppler bestimmt. Die Analyse wurde mit der Software Vevo LAB 5.8.2 durchgeführt. Jeder Parameter wurde dreimal gemessen und der Mittelwert ermittelt.2.5 Hämodynamische und morphologische AnalyseDie Tiere wurden mit Isofluran (4 %, 0,8 ml/min O 2 ; Abbott Laboratories Ltd, Queenborough, UK) anästhesiert und der rechtsventrikuläre systolische Druck (RVSP) sowie der mittlere arterielle Blutdruck (MABP) wie zuvor beschrieben bestimmt  [14]  ,  [24]  . Nach hämodynamischen Messungen wurden die Tiere durch Ausbluten getötet (unter Isofluran-Anästhesie, wie oben), die Herzen entfernt und das Verhältnis von rechtem Ventrikel zu linkem Ventrikel plus Septum [RV/(LV + S)] als Maß für die RVH bestimmt.2.6 Lungengefäßfunktion​Aus SuHx-Mäusen isolierte Pulmonalarterienringe (2. Ordnung) wurden für die isometrische Spannungsmessung vorbereitet, wie wir bereits zuvor beschrieben haben  [21]  . Die Gefäße wurden mit einer EC80- Konzentration von U46619 vorkontrahiert und die Endothelfunktion anhand der Relaxationsreaktion auf Acetylcholin (1 nM–10 µM) bestimmt. Anschließend wurden Konzentrations-Wirkungs-Kurven für den Alpha-Adrenozeptor-Agonisten Phenylephrin (1 nM–30 µM), das C-Typ natriuretische Peptid (CNP; 1 nM–1 µM) oder den selektiven NPR-C-Agonisten cANF 4–23 (1 nM–1 µM) erstellt.2.7 Quantitative Echtzeit-Polymerase-KettenreaktionGesamt-RNA wurde aus 10 bis 20 mg Lungen- oder RV-Homogenat mithilfe eines Standard-Extraktionskits (RNeasy Mini Kit, Qiagen, UK) extrahiert und 1 µg in cDNA transkribiert (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; Thermo Fisher Scientific, UK). Die resultierende cDNA wurde einer PCR mit PowerUp™ SYBR™ Green (Applied Biosystems, Life technologies Ltd., UK) und einem Bio-Rad CFX96 Connect Real-Time PCR-Detektionssystem (Bio-Rad, Kalifornien, USA) unterzogen. Genspezifische Primer sind in  Tabelle 2 der Zusatzinformationen  aufgeführt .2.8 Gewebefixierung​Bei einer Untergruppe von Mäusen wurde der linke Vorhof an Ort und Stelle entfernt und 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den RV injiziert, um restliches Blut aus den Lungengefäßen zu spülen. Dann wurde eine Kanüle in die Trachea eingeführt und die Lungen durch vorsichtige Infusion von 10 % neutralgepuffertem Formalin (Sigma Aldrich, UK) aus einem Reservoir bei einem konstanten Flüssigkeitsdruck von 20 cm H 2 O aufgeblasen. Nachdem die Lungen vollständig aufgeblasen waren, wurden Herz und Lunge zusammen aus dem Brustkorb entfernt und über Nacht in 10 % Formalin eingelegt. Nach 24 Stunden wurden die Proben aus dem Formalin genommen, mit PBS gewaschen und zur Einbettung in Paraffinwachs bei 4 °C in 70 % EtOH (Fisher Scientific Ltd, Leicestershire, UK) gelagert.2.9 . Picrosiriusrot-FärbungFixierte Herzen wurden in Paraffinwachs eingebettet und zu 5 µm dicken Querschnitten verarbeitet. Die Schnitte wurden mit Pikrosiriusrot (0,1 % w/v Direct Red 80 in Pikrinsäure; Sigma Aldrich, UK) gefärbt, um die Kollagenablagerung zu bestimmen. Ein NanoZoomer S210 Slide Scanner (Hamamatsu, Hertfordshire, UK) wurde verwendet, um Bilder der Gewebeschnitte (20-fache Vergrößerung) aufzunehmen. Die Bilder wurden mittels Schwellenwertanalyse mit Image J (NIH, USA) analysiert, wobei der Untersucher über die Behandlung im Unklaren blieb. Die Fibrosewerte wurden als Prozentsatz der gesamten Schnittfläche angegeben.2.10 . α-SMA-FärbungGanze Lungen wurden in einzelne Lappen zerlegt, die jeweils entlang der Querebene halbiert wurden. Die untere Hälfte jedes Lappens wurde in Paraffinwachs eingebettet (5 Lappen pro Block) und zu sagittalen Schnitten (4 µm) verarbeitet. Die Schnitte wurden mit Anti-α-Smooth-Muscle-Actin (α-SMA)-Antikörper (1:8000, A2547, Sigma, UK) gefärbt und mithilfe des Ventana Discovery XT-Geräts des Barts Cancer Institute Pathology Services (Queen Mary University of London, UK) leicht mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Objektträger wurden mit einem NanoZoomer S210-Objektträgerscanner (Hamamatsu, Hertfordshire, UK) bei 20-facher Vergrößerung abgebildet. Für jeden Lappen wurden in einem zufällig ausgewählten Feld Pulmonalarterien mit einem Außendurchmesser von ≤ 80 μm  [21]  ,  [24]  identifiziert. Die Gefäße wurden blind bewertet und entweder als nicht muskularisiert (Färbung deckt ≤ 50 % des Gefäßumfangs ab) oder als muskularisiert (Färbung deckt ≥ 50 % des Gefäßumfangs ab). Der prozentuale Anteil der Muskularisierung wurde für jedes Tier als Anzahl der umgestalteten Arterien geteilt durch die Gesamtzahl der gezählten Gefäße (≥ 30 pro Abschnitt) definiert.2.11 Biochemische AnalysenDie Plasmakonzentrationen von ANP und CNP wurden mit kommerziell erhältlichen EIAs (Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Deutschland) bestimmt, wie bereits beschrieben  [25]  . Kurz gesagt wurden natriuretische Peptide mithilfe von C18-Säulen (Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Deutschland) aus den Abwasserproben extrahiert. Die Elutionsmittel wurden anschließend über Nacht in einem Zentrifugalkonzentrator (Speedvac, Thermo Scientific, USA) zur Trockne eingedampft. Die Proben wurden in 125 μl Assay-Puffer rekonstituiert und der EIA gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.Die cGMP-Konzentrationen in Plasma und Lungenhomogenaten wurden mit einem kommerziell erhältlichen ELISA-Kit (Direct cGMP ELISA, Enzo Life Sciences, Exeter, UK) gemessen, wie bereits beschrieben  [26]  . Der Test wurde für alle Proben im acetylierten (hochempfindlichen) Format gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Plasma-cGMP-Konzentrationen wurden auf das Probenvolumen normalisiert, während die Lungen-cGMP-Konzentrationen auf das Gewebegewicht normalisiert wurden.2.12 Immunblotting​Das Immunoblotting wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt  [5]  ,  [26]  . Kurz gesagt wurden schockgefrorene Lungenproben in SDS-Lysepuffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Thermofisher, UK) homogenisiert und die Proteinkonzentrationen bestimmt. Standard-SDS-PAGE-Protokolle mit 4–10 % Tris-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden verwendet, um den Knochenmorphogenetischen Proteinrezeptor Typ 2 (BMPR2) (1:3000, ab96826, Abcam), Phospho-Smad1/5/8 (1:3000, ab76296, Abcam) und Gesamt-Smad1 (1:2000, ab63356, Abcam) zu identifizieren. α-Tubulin (1:2000; T9026, Sigma UK) wurde als Ladekontrolle verwendet. Die densitometrische Analyse erfolgte mit Image J. BMPR2-Daten wurden auf α-Tubulin normalisiert, während die Phospho-Smad1/5/8-Werte auf das Gesamt-Smad1-Protein und α-Tubulin normalisiert wurden. Die Daten sind relativ zur normoxischen Kontrollgruppe dargestellt.2.13 Datenanalyse​Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism (Version 9; GraphPad Software, Kalifornien, USA) durchgeführt, nachdem die Normalverteilung der Daten mit einem Shapiro-Wilk-Test bestätigt worden war. Gegebenenfalls wurden ein zweiseitiger, ungepaarter Student- t -Test, eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA, gefolgt von einem Šídák-Test für Mehrfachvergleiche (mit Korrektur für Multiplizität), verwendet. Statistische Signifikanz wurde als P  < 0,05 definiert, und die in jeder Abbildung dargestellten P- Werte geben alle durchgeführten Vergleiche an.3. Ergebnisse​3.1 . Die kardiopulmonale Expression von CNP und NPR ist bei experimenteller PH und PH-Patienten gestörtDie Expression von Nppc (CNP) in der Lunge blieb bei WT-SuHx-Tieren im Vergleich zu NmOx-Kontrollen unverändert, obwohl eine deutliche Herunterregulierung von Npr2 (NPR- und Npr3 (NPR-C) erkennbar war (  Abb. 1  A). Im Gegensatz dazu waren die Nppc- mRNA-Spiegel im hypertrophen RV von SuHx-Tieren signifikant reduziert (  Abb. 1  C), einhergehend mit einer deutlichen Abnahme der Npr3- Expression; im RV war die Expression von Npr2 jedoch nach Exposition gegenüber SuHx hochreguliert (  Abb. 1  C).

1. Download: Bild mit hoher Auflösung herunterladen (632 KB)
2. Download: Bild in voller Größe herunterladen

Abb. 1. Die Expression von CNP, NPR-B und NPR-C ist bei experimenteller PH und Patienten mit dieser Störung gestört. Expression von C-Typ natriuretischem Peptid (CNP; Nppc/NPPC ), natriuretischem Peptidrezeptor (NPR)-B ( Npr2/NPR2 ) und NPR-C ( Npr3/NPR3 ) mRNA in den Lungen ( A ) und der rechten Herzkammer (RV; C ) von Wildtyp-Tieren unter normoxischen Bedingungen (NmOx) oder nach Exposition gegenüber Sugen + Hypoxie (SuHx), oder in glatten Muskelzellen der Lungenarterie (PASMC), isoliert von Kontrollpersonen und Patienten mit pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) ( B ), oder in RV-Biopsien von Patienten mit chronischer thromboembolischer PH (CTEPH) vor (Prä) und nach (Post) chirurgischer Thrombendarteriektomie ( D ). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM mit statistischer Analyse durch den t -Test nach Student dargestellt . Jedem durchgeführten statistischen Vergleich ist ein P- Wert (bereinigt um Multiplizität) zugewiesen. n  = 4–14.Ein ähnliches Muster einer gestörten Expression von CNP-gesteuerten Signalkomponenten wurde bei PH-Patienten beobachtet. In glatten Muskelzellen der Lungenarterie von Patienten mit idiopathischer PH war die NPR2- Expression verringert, obwohl keine Veränderungen in der NPPC- und NPR3- mRNA-Häufigkeit erkennbar waren (  Abb. 1B  ). Eine Thrombendarteriektomie (d. h. Entfernung der RV-Nachlast) bei CTEPH-Patienten führte zu einer Hochregulierung der NPPC -Expression im RV, reduzierte jedoch die NPR3 -mRNA-Häufigkeit (NPR-C wird im RV von CTEPH-Patienten stark exprimiert (  Ergänzende Abbildung 1  ); die NPR2- Expression veränderte sich kaum oder gar nicht (  Abb. 1D  ). Außerdem wurden die CNP-Konzentrationen im Plasma (aber nicht die ANP-Konzentrationen im Plasma, die dazu neigten, geringfügig anzusteigen) durch die Einwirkung von SuHx signifikant verringert (  Ergänzende Abbildung 2A  ,. Diese Daten zeigen, dass die CNP/NPR-Signalgebung in der Lunge und im RV von Mäusen mit experimenteller PH und von PH-Patienten gestört ist.3.2 . Endotheliale CNP-Deletion verschlimmert die Schwere der Erkrankung bei experimenteller PHWährend der Verlust von endothelialem CNP keine Auswirkungen auf die systemische und pulmonale Gefäßfunktion zu Studienbeginn hatte (  Abb. 2A  –F ), wiesen SuHx-behandelte ecCNP -/- Mäuse im Vergleich zu WT-Wurfgeschwistern einen signifikant erhöhten RVSP auf (  Abb. 2A  ) . Gleichzeitig zeigte sich bei diesen Tieren ein leichter, aber signifikanter Anstieg des MABP (  Ergänzende Tabelle 1  ). Darüber hinaus verstärkte diese Erhöhung der Rechtsherznachlast (RVSP) die Entwicklung von RVH (RV/[LV+S]-Verhältnis;  Abb. 2B  ) und RV-Fibrose (  Abb. 2D  ,F ) bei diesen Tieren. In Übereinstimmung mit dem erhöhten Druck im Lungenkreislauf war bei ecCNP -/- Tieren im Vergleich zu ihren Wurfgeschwistern eine signifikante Zunahme der Gefäßmuskularisierung erkennbar (  Abb. 2C  ,E ). Darüber hinaus führte die genetische Deletion von CNP aus dem Endothel zu einer hochregulierten Expression von Nppa (ANP), Nppb (BNP), Tgf-β1 (Transforming Growth Factor β, TGF-β) und Fn1 (Fibronektin) im RV, was mit einem profibrotischen, prohypertrophen Phänotyp übereinstimmt (  Ergänzende Abbildung 3  ). Diese Daten legen nahe, dass vom pulmonalen Gefäßendothel freigesetztes CNP eine intrinsische Wirtsabwehrkapazität besitzt, die der Entwicklung von PH entgegenwirkt.

1. Download: Bild mit hoher Auflösung herunterladen (751 KB)
2. Download: Bild in voller Größe herunterladen

Abb. 2. Die Auswirkung der Deletion endothelialer CNP auf Indizes der Schwere der Erkrankung bei experimenteller PH. Rechtsventrikulärer systolischer Druck (RVSP; A ), rechtsventrikuläre Hypertrophie (RV/[LV+S]; B ), pulmonalvaskuläre Muskularisierung ( C ; mit repräsentativen Bildern E ; Maßstab = 20 μm) und RV-fibrotische Belastung ( D ; mit repräsentativen Bildern F ) bei normoxischen (NmOx) und Sugen + Hypoxie (SuHx) Wildtyp- (WT) und endothelial-spezifischen C-Typ natriuretischen Peptid-Knockout-Mäusen (ecCNP -/- ). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM mit statistischer Analyse durch einfaktorielle ANOVA mit Šidák-Post-hoc-Test dargestellt. Jedem durchgeführten statistischen Vergleich ist ein P- Wert zugewiesen (bereinigt um Multiplizität). n  = 10–16.3.3 . NPR-B- und NPR-C-gesteuerte vasorelaxierende Reaktionen im Lungenkreislauf sind bei PH abgeschwächtDie endothelabhängige Dilatation auf Acetylcholin wurde durch SuHx reduziert, ein Phänotyp, der mit einem der Haupttreiber der PH-Pathogenese, der endothelialen Dysfunktion, übereinstimmt (  Abb. 3  A ). Die Vasokonstriktor-Empfindlichkeit wurde jedoch nicht signifikant verändert (  Abb. 3  B ). Interessanterweise wurden die vasorelaxierenden Reaktionen auf CNP in Gefäßen von SuHx-Mäusen eingeschränkt und außerdem wurde die vasorelaxierende Aktivität des NPR-C-selektiven Agonisten cANF 4–23 durch die SuHx-Exposition im Wesentlichen aufgehoben (  Abb. 3  C,D ), obwohl die übergreifende Wirksamkeit und Effizienz dieses Liganden im Vergleich zu CNP reduziert war. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einer Herunterregulierung der NPR-B- und NPR-C-Expression im Lungenkreislauf im Rahmen von PH (  Abb. 1  A ).

1. Download: Bild mit hoher Auflösung herunterladen (242 KB)
2. Download: Bild in voller Größe herunterladen

Abb. 3. Der Verlust der CNP-Vasoaktivität trägt zur Gefäßfunktionsstörung bei experimenteller PH bei. Konzentrations-Wirkungs-Kurven für den endothelabhängigen Dilatator Acetylcholin (ACh, A ), den α-Adrenozeptor-Agonisten Phenylephrin (Phe, B ), das C-Typ-natriuretische Peptid (CNP, C ) und den selektiven Natriuretischen Peptidrezeptor (NPR)-C-Agonisten cANF 4–23 ( D ) in Pulmonalarterien 2. Ordnung, isoliert aus normoxischen (NmOx) und Sugen + Hypoxie (SuHx) Wildtyp (WT)-Mäusen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM mit statistischer Analyse durch zweifaktorielle ANOVA dargestellt. Jedem durchgeführten statistischen Vergleich ist ein P- Wert (bereinigt um Multiplizität) zugewiesen. n  = 8–12.3.4 . Die globale NPR-C-Deletion verschlimmerte die RV-Hypertrophie und Fibrose bei experimenteller PHParallel dazu wurden Untersuchungen an globalen NPR-C -/- Tieren durchgeführt, um festzustellen, welcher verwandte Rezeptor, NPR-B oder NPR-C, den bei ecCNP -/- SuHx-Mäusen beobachteten schädlichen Effekten zugrunde liegt . Die globale Deletion von NPR-C hatte keine Auswirkungen auf RVSP, MABP oder die pulmonalarterielle Muskulatur bei NmOx- oder SuHx-Tieren. Dies legt nahe, dass die Regulierung des pulmonalarteriellen Drucks durch endotheliales CNP weitgehend NPR-B-abhängig ist (  Abb. 4  A, C, E und  ergänzende Tabelle 1  ). Im krassen Gegensatz dazu verschlimmerte die Deletion von NPR-C die (mal)adaptive Reaktion des RV auf SuHx und erhöhte das RV/[LV+S]-Verhältnis und die fibrotische Belastung signifikant (  Abb. 4  B, D, F ). Dieser Phänotyp wurde durch eine qPCR-Analyse einer Gruppe etablierter pro-hypertropher, pro-fibrotischer Mediatoren, darunter Nppa , Nppb , Tgf-β1 und Fn1, bestätigt (was die Ergebnisse bei ecCNP -/-- Tieren widerspiegelt;  ergänzende Abbildung 3A  ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein doppelter Beitrag der NPR-B-Signalgebung (vasozentrisch) und NPR-C-Signalgebung (kardialzentrisch) zu den heilsamen Wirkungen von CNP im Zusammenhang mit PH beiträgt.

1. Download: Bild mit hoher Auflösung herunterladen (693 KB)
2. Download: Bild in voller Größe herunterladen

Abb. 4. Die Auswirkung der globalen NPR-C-Deletion auf Indizes der Schwere der Erkrankung bei experimenteller PH. Rechtsventrikulärer systolischer Druck (RVSP; A ), rechtsventrikuläre Hypertrophie (RV/[LV+S]; B ), pulmonalvaskuläre Muskularisierung ( C ; mit repräsentativen Bildern E ; Maßstab = 20 μm) und RV-fibrotische Belastung ( D ; mit repräsentativen Bildern F ) bei normoxischen (NmOx) und Sugen + Hypoxie (SuHx) Wildtyp- (WT) und globalen natriuretischen Peptidrezeptor (NPR)-C-Knockout-Mäusen (NPR-C -/- ). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM mit statistischer Analyse durch einfaktorielle ANOVA mit Šidák-Post-hoc-Test dargestellt. Jedem durchgeführten statistischen Vergleich ist ein P- Wert zugewiesen (bereinigt um Multiplizität). n  = 10–16.3.5 . Die Deletion von CNP in Kardiomyozyten übt einen moderaten Schutzeffekt bei experimenteller PH ausNachdem wir festgestellt hatten, dass die Deletion von NPR-C zu einer Verschlimmerung struktureller Herzdefizite führt, untersuchten wir den Einfluss einer auf Kardiomyozyten beschränkten CNP-Deletion im gleichen Kontext. Dabei zeigten cmCNP -/- Mäuse im Vergleich zu WT-Wurfgeschwistern keine signifikanten Veränderungen bei RVH, RV-Fibrose oder MABP (  Abb. 5  B, D, F und  ergänzende Tabelle 1  ). Die auf Kardiomyozyten beschränkte CNP-Deletion führte jedoch unerwartet zu einem leichten Rückgang des RVSP nach Exposition gegenüber SuHx, der sich in einer Verringerung der Muskulatur der kleinen Lungenarterien widerspiegelte (  Abb. 5  A, C, E ). Dieser überraschende „schützende“ Phänotyp, der bei cmCNP -/- Tieren beobachtet wurde, wurde durch die Untersuchung der Herzstruktur und -funktion mittels Echokardiographie weiter untersucht. Während die Indizes der RV-Struktur nicht vom Genotyp beeinflusst wurden, blieb die Hämodynamik der Pulmonalarterie (d. h. das PAT/RVET-Verhältnis und der TV-Spitzenfluss) bei cmCNP -/-- Tieren im Vergleich zu WT-Wurfgeschwistern stärker erhalten (  Ergänzende Abbildung 4A  –F ). Darüber hinaus führte die auf Kardiomyozyten beschränkte Deletion von CNP sogar unter normoxischen Bedingungen zu einer leichten Erhöhung der Expression prohypertropher, proinflammatorischer Mediatoren im RV, und die Häufigkeit von Nppc -mRNA im RV war bei NmOx cmCNP -/-- Tieren ebenfalls signifikant erhöht (  Ergänzende Abbildung 3  ), was darauf hindeutet, dass andere Zelltypen im rechten Herzen die Produktion des Peptids steigern, um den Verlust des aus Kardiomyozyten stammenden CNP zu kompensieren.

1. Download: Bild mit hoher Auflösung herunterladen (701 KB)
2. Download: Bild in voller Größe herunterladen

Abb. 5. Die Auswirkung der Deletion von CNP in Kardiomyozyten auf Indizes der Schwere der Erkrankung bei experimenteller PH. Rechtsventrikulärer systolischer Druck (RVSP; A ), rechtsventrikuläre Hypertrophie (RV/[LV+S]; B ), pulmonalvaskuläre Muskularisierung ( C ; mit repräsentativen Bildern E ; Maßstab = 20 μm) und fibrotische Belastung des rechten Ventrikels ( D ; mit repräsentativen Bildern F ) bei normoxischen (NmOx) und Sugen + Hypoxie (SuHx) Wildtyp- (WT) und kardiomyozytenspezifischen C-Typ natriuretischen Peptid-Knockout-Mäusen (cmCNP -/- ). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM mit statistischer Analyse durch einfaktorielle ANOVA mit Šidák-Post-hoc-Test dargestellt. Jedem durchgeführten statistischen Vergleich ist ein P- Wert (bereinigt um Multiplizität) zugewiesen. n  = 10–16.3.6 . CNP-Infusion reduziert die Schwere der Erkrankung bei experimenteller PHAls nächstes untersuchten wir das Potenzial von CNP als Therapeutikum bei PH, insbesondere da frühere Berichte widersprüchliche Informationen bezüglich der Wirksamkeit der CNP-Gabe bei dieser Erkrankung bieten  [9]  ,  [10]  ,  [11]  . Die zirkulierenden CNP-Werte waren bei WT-Mäusen, die SuHx ausgesetzt waren, signifikant reduziert, wurden aber durch die pharmakologische CNP-Gabe auf normoxische Werte zurückgeführt (  Ergänzende Abbildung 2  A ). Im Gegensatz dazu gab es keine klare Wirkung der SuHx- oder CNP-Infusion auf die ANP-Konzentrationen im Plasma (  Ergänzende Abbildung 2B  ). Die Plasmaspiegel von zyklischem Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP) wurden durch SuHx leicht erhöht, ein Effekt, der sich nach der CNP-Behandlung umkehrte, während sich die cGMP-Konzentrationen in der Lunge nach der Exposition gegenüber SuHx oder der Gabe von CNP nicht offensichtlich änderten (  Ergänzende Abbildung 2  C,D ). Die CNP-Infusion senkte den RVSP bei WT-Mäusen, die SuHx ausgesetzt waren, signifikant (  Abb. 6  A ). Entscheidend ist, dass das Ausbleiben eines gleichzeitigen MABP-Abfalls auf eine gewisse pulmonale Selektivität hindeutet (  Ergänzende Tabelle 1  ). In Übereinstimmung damit kehrte die CNP-Gabe auch die RV-Umgestaltung (RV/[LV+S]) und die RV-Fibrose signifikant um (  Abb. 6B  –D ). Und schließlich wurde die verringerte Expression von NPR-B- und NPR-C-mRNA in der Lunge als Reaktion auf SuHx nach der CNP-Infusion wiederhergestellt (  Ergänzende Abbildung 2E  , F ). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die pharmakologische CNP-Gabe zur Aufrechterhaltung der pulmonalen Hämodynamik und der RV-Struktur/-Funktion im Rahmen von PH von Vorteil ist und die Hochregulierung verwandter Rezeptoren fördern kann, die diese positiven Wirkungen vermitteln.

1. Download: Bild mit hoher Auflösung herunterladen (699 KB)
2. Download: Bild in voller Größe herunterladen

Abb. 6. Pharmakologische CNP-Infusion reduziert die Schwere der Erkrankung bei experimenteller PH. Rechtsventrikulärer systolischer Druck (RVSP; A ), rechtsventrikuläre Hypertrophie (RV/[LV+S]; B ), fibrotische Belastung des rechten Ventrikels ( C ; mit repräsentativen Bildern, D ; Maßstab = 20 μm) und mRNA- und Proteinexpression von pro-remodellierenden und pro-fibrotischen Mediatoren ( E ) bei normoxischen (NmOx) und Sugen + Hypoxie (SuHx) Wildtypmäusen in Abwesenheit und Anwesenheit von C-Typ natriuretischem Peptid (CNP; 0,2 mg/kg/Tag; osmotische Minipumpe). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM mit statistischer Analyse mittels Student- t -Test oder einfaktorieller ANOVA mit Šidák-Post-hoc-Test dargestellt. Jedem durchgeführten statistischen Vergleich ist ein P- Wert (adjustiert für Multiplizität) zugewiesen. n  = 7–8.3.7 . CNP-Infusion hemmt die Remodeling-assoziierte Genexpression bei experimenteller PHUm Einblicke in die molekularen Wege zu gewinnen, die der therapeutischen Wirkung von CNP im SuHx-Mausmodell zugrunde liegen, wurde die mRNA-Expression des Knochenmorphogenetischen Proteinrezeptors Typ 2 ( Bmpr2 ; ein etablierter kausaler Faktor bei menschlicher PH) und seiner nachgeschalteten Effektoren (Smad-Proteine) in den Lungen von WT-SuHx-Mäusen in Abwesenheit und Anwesenheit von CNP untersucht.Ähnlich wie bei der menschlichen PH war die Bmpr2- Expression bei SuHx-Mäusen signifikant reduziert, aber entscheidend war, dass die CNP-Gabe die Bmpr2 -mRNA und die Proteinhäufigkeit auf ein Niveau steigerte, das mit NmOx-Kontrollen vergleichbar war (  Abb. 6E  ) . Die Transkription von Smad5 und Smad7 war bei CNP-behandelten Mäusen ebenfalls signifikant hochreguliert und dementsprechend wurden auch die Phospho-Smad1/5/8-Spiegel durch die CNP-Gabe verstärkt (  Abb. 6E  ) . Die Expression von pro-hypertrophen und pro-fibrotischen Markern im RV wurde ebenfalls untersucht. Bei SuHx-Tieren war die Genexpression des ventrikulären Stresshormons BNP ( Nppb ) im Vergleich zu NmOx-Kontrollen erhöht (  Ergänzende Abbildung 3  ). Darüber hinaus waren Tgf-β1 und Fn1 im RV in ähnlicher Weise hochreguliert (  Abb. 6E  ) .4. Diskussion​PH ist eine stark beeinträchtigende Erkrankung, die durch endotheliale Dysfunktion, pulmonalvaskuläre Umgestaltung und RV-Versagen verursacht wird  [1]  . Gezielte pharmakologische und/oder chirurgische Interventionen verbessern zwar die Ergebnisse deutlich, dennoch entwickelt die Mehrheit der Patienten eine tödliche Rechtsherzinsuffizienz  [2]  . Pulmonale Vasodilatatoren bilden das Rückgrat der Therapie, es fehlt jedoch weiterhin an krankheitsmodifizierenden Behandlungen, die auf andere Aspekte der Pathophysiologie abzielen, darunter vaskuläre Umgestaltung, Entzündung, Stoffwechselstörungen und RV-Dysfunktion. Sotatercept, ein Fusionsprotein, das Aktivine und wachstumsdifferenzierende Faktoren abfängt, die eine abweichende TGF-β-Signalgebung fördern, die wiederum das Fortschreiten der Krankheit vorantreibt, hat sich kürzlich in groß angelegten randomisierten kontrollierten Studien mit PAH-Patienten als vielversprechend erwiesen  [27]  und stellt eine neue Medikamentenklasse dar, die einige dieser zusätzlichen pathogenen Prozesse direkt behebt. Es besteht jedoch dringender Bedarf an Therapien der nächsten Generation, die auf neuen, krankheitslimitierenden Zielen basieren. In dieser Hinsicht reguliert CNP zahlreiche pathogene Prozesse, die für die Pathophysiologie der PH relevant sind, darunter die Endothelfunktion, die Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen, die Reaktivität von Immunzellen, die metabolische Homöostase und die kardiale Umgestaltung  [28]  . Hierin liefern wir Beweise dafür, dass die endogene Freisetzung von CNP, hauptsächlich aus Endothelzellen, durch Aktivierung zweier verwandter Rezeptoren (NPR-B und NPR-C) vor der Entwicklung von PH schützt und dass die exogene Verabreichung von CNP Potenzial für die Therapie von PH birgt.Zunächst stellten wir fest, dass die Expression von CNP und den verwandten Rezeptoren NPR-B und NPR-C im kardiopulmonalen Kreislauf von Mäusen mit experimenteller PH und bei Patienten mit der Krankheit gestört ist. Dies deutet darauf hin, dass das Peptid zur Hemmung der Pathogenese beitragen könnte. Eine analoge Dysregulation wurde bei Ratten beobachtet, die chronischer Hypoxie ausgesetzt waren  [17]  . Die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch unklar, aber eine These besagt, dass die durch Hypoxie induzierte Herunterregulierung von NPR-C die Hochregulierung der Wachstumsfaktoren in den glatten Muskelzellen der Lungengefäße fördert, die als pathogen bei PH bekannt sind  [29]  . Veränderungen in der Expression von CNP und NPR im hypertrophierten RV sind auch bei experimenteller PH  [17]  ,  [18]  erkennbar , ebenso wie eine veränderte CNP/NPR-Expression und/oder bei PH-Patienten  [20]  . Hier stellten wir eine signifikante Herunterregulierung der CNP-mRNA-Expression im RV von Patienten mit CTEPH im Vergleich zu denselben Personen nach Endarteriektomie fest (d. h. reduzierte Nachlast). Im Gegensatz dazu war die NPR-C-Expression während der Erkrankung erhöht, nach Beseitigung der RV-Drucküberlastung jedoch reduziert. Bei PH-Patienten scheint daher die Ligandenverfügbarkeit reduziert, die Rezeptorexpression jedoch hochreguliert zu sein, vermutlich um den Verlust des endogenen Agonisten (d. h. CNP) zu kompensieren.Die Rolle von endogenem CNP bei der Aufrechterhaltung des Gefäßtonus im systemischen Kreislauf ist gut belegt  [3]  ,  [30]  ,  [31]  . Über die Wirkung des Peptids im Lungenkreislauf ist jedoch vergleichsweise wenig bekannt. Hier zeigen wir, dass CNP die Gefäße von NmOx-Mäusen leicht entspannt, was frühere Arbeiten mit proximalen intralobulären Lungenarterien von Ratten bestätigt  [17]  . Im Vergleich zu CNP ist der NPR-C-selektive Agonist cANF 4–23 ein relativ mäßiges Vasorelaxans, was darauf hindeutet, dass NPR-B hauptsächlich die vasodilatatorische Aktivität des Peptids im Lungenkreislauf steuert, zumindest in diesen Gefäßen zweiter Ordnung. Dies passt zu der Annahme, dass beim Übergang der Leitfähigkeitsgefäße in die Mikrozirkulation der Beitrag von NPR-C zum Gefäßtonus stark ansteigt und die Aktivierung dieses Rezeptors durch CNP eine Komponente der Endothel-abgeleiteten Hyperpolarisation (EDH) darstellt  [3]  . Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass endogenes CNP und NPR-C bei der Regulierung des pulmonalen Gefäßtonus im gesunden Zustand kaum oder gar keine Rolle spielen, da der RVSP bei naiven ecCNP -/- und NPR-C -/- Tieren unverändert blieb. Diese Beobachtungen stehen im Widerspruch zu früheren Berichten, denen zufolge die Infusion von cANF 4–23 den RVSP bei NmOx-Mäusen senkt und ein NPR-C-Mangel den kardiopulmonalen Druck signifikant erhöht  [13]  . Allerdings zeigen wir hier, dass die Exposition gegenüber SuHx die pulmonale NPR-Expression unterdrückt und dies zu einer moderaten Reduktion der gefäßerweiternden Aktivität von CNP und cANF 4–23 führt , was scheinbar früheren Befunden an proximalen intrapulmonalen Arterien von an Hypoxie angepassten Ratten entspricht  [17]  . Darüber hinaus führt die auf Endothelzellen beschränkte Deletion von CNP zu einer Zunahme des Schweregrads der Erkrankung, die durch eine verstärkte kardiopulmonale Drucküberlastung und einen Umbau der Lungengefäße gekennzeichnet ist. Interessanterweise verstärkt die globale Deletion von NPR-C die hypertrophe Reaktion der rechten Herzhälfte und die damit verbundene Fibrose, verändert jedoch nicht die Reaktivität oder den Umbau der Lungengefäße. Dies legt nahe, dass NPR-B und NPR-C komplementäre Rollen beim Schutz des Lungenkreislaufs bzw. des RV bei dieser Erkrankung spielen. Interessanterweise sind die Expression des ET-1-Gens durch pulmonale vaskuläre Endothelzellen und die zirkulierenden ET-1-Konzentrationen bei ecCNP -/- Tieren erhöht  [30]  , was mit einem früheren Bericht übereinstimmt, der die hemmende Wirkung von CNP auf die ET-1-Produktion durch vaskuläre Endothelzellen beschreibt  [32]  . Angesichts der Relevanz von ET-1 für die Pathophysiologie der PH  [33]  ist es plausibel, dass eine erhöhte ET-1-Produktion in den Lungenarterien zum verstärkten PH-Phänotyp beiträgt, der bei ecCNP -/- beobachtet wird.Mäuse. Tatsächlich ist der Einfluss von CNP auf die Gefäßumgestaltung gut erforscht  [34]  , und das Peptid wirkt nachweislich der Expression, Freisetzung und Aktivierung mehrerer Matrixumgestaltungsmoleküle, darunter MMPs, entgegen  [35]  . Ähnlich den vaskulären Wirkungen von CNP scheinen sowohl NPR-B als auch NPR-C die Anti-Umgestaltungseffekte des Peptids zu vermitteln. Bei Venentransplantaten und Ballonangioplastie beispielsweise hängt die heilsame Wirkung von CNP von der NPR-B-Signalgebung ab  [34]  . Neuere Arbeiten haben eine deutlich hemmende Wirkung von CNP auf Perizyten von Patienten mit PH gezeigt  [12]  . Dennoch kommt es bei Mäusen, die genetisch null für aus dem Endothel stammendes CNP oder NPR-C sind, nach Gefäßverletzungen zu einer verstärkten Intimahyperplasie  [5]  . Dieser Befund steht im Einklang mit der verringerten Proliferation von NPR-C -/- pulmonalen mikrovaskulären endokrinen Zellen und dem beschleunigten Wachstum von NPR-C -/- vaskulären glatten Muskelzellen  [36]  . Insgesamt stützen diese Beobachtungen eine Doppelrolle von NPR-B und NPR-C bei der Untermauerung der positiven Wirkung von CNP im Lungengefäßsystem im Rahmen von PH.Die basale Expression von CNP im Herzen ist gering, insbesondere im Vergleich zu ANP und BNP  [37]  . Dies lässt darauf schließen, dass das Peptid bei der Regulierung der Herzmorphologie oder -funktion bei gesunden Probanden keine bedeutende Rolle spielt. Dieses Paradigma wird durch das Fehlen eines allgemeinen kardialen Phänotyps bei naivem cmCNP -/- mic e  [4]  bestätigt und durch das Fehlen einer hier beschriebenen veränderten RV-Morphologie weiter untermauert. Anders als beim LV als Reaktion auf Drucküberlastung  [4]  bleibt die Entwicklung einer RVH durch eine kardiomyozytenspezifische CNP-Deletion jedoch unverändert, obwohl die Expression mehrerer pro-remodellierender Mediatoren und der ATPase des sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulums ( Atp2a2 ; SERCA2a) reduziert war. Dies steht in scharfem Kontrast zur auf Kardiomyozyten beschränkten CNP-Deletion in experimentellen Modellen eines LV-Versagens (d. h. HFrEF), bei denen der Phänotyp offensichtlich verschlechtert ist  [4]  . Diese dichotomen Beobachtungen zeigen einen deutlichen Unterschied zwischen Kardiomyozyten im RV und LV hinsichtlich der CNP-Freisetzung und -Funktionalität und implizieren, dass eine kompensatorische Hochregulierung der intrinsischen CNP-Produktion durch andere Zelltypen (z. B. Endothelzellen, Fibroblasten) im RV und im Lungenkreislauf stattfindet, nicht jedoch im LV und im systemischen Kreislauf. Wie oben beschrieben, hemmt die Sekretion von CNP aus aktivierten Fibroblasten die Umbauprozesse im gestressten Myokard, zumindest im LV  [4]  . Überraschenderweise wurde die Entwicklung einer kardiopulmonalen Drucküberlastung und einer pulmonalen Gefäßumgestaltung bei cmCNP -/- SuHx-Mäusen gemildert, vermutlich aufgrund der adaptiven Hochregulierung von CNP aus anderen Zelltypen und möglicherweise über eine „Vorbereitung“ des Systems infolge der basalen (d. h. normoxischen) Hochregulierung hypertropher und fibrotischer Bahnen, die die Wirkung der Sugen-/Hypoxie-Exposition bei diesen Tieren aufheben könnte.Die Rollen von NPR-B und NPR-C beim CNP-vermittelten kardiopulmonalen Schutz bei PH müssen noch vollständig geklärt werden. NPR-C -/- Tiere zeigen eine basale Fibrose im linken und rechten Vorhof  [38]  , die durch Ang II-induzierte Drucküberlastung verstärkt wird  [39]  . Dabei verstärkte die Deletion von NPR-C die Hypertrophie und fibrotische Belastung des RV. Diese Beobachtungen legen nahe, dass endogenes CNP die hypertrophe Reaktion des rechten Herzens über NPR-C-Signalgebung moduliert. Die Aktivierung von NPR-C durch ANP und BNP, die beide auch in vivo vor PH und der begleitenden RVH schützen  [40]  ,  [41]  (und zur Aufrechterhaltung der endothelialen Integrität nach akuter Lungenschädigung beitragen  [42]  ,  [43]  ), könnte ebenfalls zu diesem heilsamen Effekt beitragen. Diese Erkenntnisse weichen von einem früheren Bericht ab, wonach NPR-C zur Entwicklung von RVH in einem Modell von durch Fettleibigkeit induzierter PH-HFpEF beiträgt  [44]  . In dieser Studie wurde postuliert, dass die Überexpression von NPR-C die CNP-Clearance gegenüber der Signalgebung begünstigt und somit die schützende Wirkung des Peptids neutralisiert. Tatsächlich deutet unsere Arbeit darauf hin, dass bestimmte Indizes der Schwere der Erkrankung, darunter die Reaktivität und Umgestaltung der Lungengefäße, bei NPR-C -/- Tieren nicht verändert sind, was bedeutet, dass die NPR-B/cGMP-abhängige Signalgebung in diesen Aspekten der Pathologie wichtiger ist. In Übereinstimmung damit haben frühere Arbeiten hervorgehoben, dass einer der wichtigsten Wege, die die positiven Wirkungen von cGMP (und cGMP-generierenden Medikamenten wie Sildenafil und Riociguat) bei PH vermitteln, die Förderung der Smad1/5/8-Signalgebung ist  [45]  . dies könnte zumindest teilweise einigen der heilsamen Wirkungen von CNP (vermittelt durch BMPR2) zugrunde liegen, da man erwarten würde, dass es das Gleichgewicht zwischen den TGF-β- und BMPR2-Signalwegen wiederherstellt. Diese Vorstellung wird durch die hierin beschriebenen Beobachtungen gestützt, bei denen die CNP-Behandlung die Smad1/5/8-Phosphorylierung erhöhte. Dennoch gibt es bei experimenteller PH nur mäßige Erhöhungen der cGMP-Konzentrationen in Plasma und Lunge (hier und  [14]  ,  [24]  ,  [46]  ,  [47]  ), was einige indirekte Hinweise auf den bedeutenden Beitrag von NPR-C (das nicht cGMP-abhängig ist) liefert. Weitere Studien mit zellspezifischer Deletion von NPR-B (und NPR-C) wären hilfreich, um die zellulären Ziele zu bestimmen und den entsprechenden Rezeptor für die positiven Wirkungen von CNP bei PH zu untermauern.Das therapeutische Potenzial von CNP bei PH wurde durch die Beobachtung veranschaulicht, dass die Infusion des Peptids die pulmonale Hämodynamik sowie die Struktur und Funktion des RV bei Mäusen mit etablierter Erkrankung verbesserte. Diese Veränderungen waren mit einer erhöhten pulmonalen Expression von Bmpr2 verbunden , das das Wachstum von pulmonalarteriellen Endothelzellen und PASMC in der gesunden Lunge hemmt, bei PH jedoch herunterreguliert ist  [48]  . Die Verschiebung des Gleichgewichts in Richtung der BMPR2-Signalgebung führt wiederum zur Aktivierung der schützenden Smad5 und Smad7. Während die vorliegende Studie darauf hindeutet, dass die Smad5- Spiegel im SuHx-Mausmodell nicht signifikant herunterreguliert sind, reguliert die CNP-Behandlung die pulmonalen Smad5- mRNA-Transkripte stark hoch, was zur Umkehr des PH-Phänotyps beigetragen haben könnte. Als promiskuitiver Regulator moduliert Smad7 die TGF-β-, Activin- und BMP-Signalgebung, indem es stabile Wechselwirkungen mit aktivierten Rezeptoren bildet und so die Bindung und Aktivierung von Signalweg-beschränkten Mitgliedern der Smad-Familie verhindert  [49]  . Während über die Expression von Smad7 bei PH-Patienten nicht berichtet wurde, wurde eine verringerte Expression bei verwandten Erkrankungen wie chronisch obstruktiver Lungenerkrankung und systemischer Sklerose beobachtet  [50]  ,  [51]  . Zudem ist die Transkription dieses Smad in den Lungen von MCT-Ratten verringert  [52]  , was auf einen Beitrag zur verstärkten TGF-β-Signalgebung hindeutet. Wie hier gezeigt, war die SuHx-Exposition mit einer klaren Tendenz zur verringerten Smad7- Genexpression verbunden, die durch die CNP-Behandlung umgekehrt wurde. Somit könnten die Anti-Remodeling-Effekte von Smad7 zu den hier gezeigten positiven Wirkungen der CNP-Infusion beigetragen haben. Dementsprechend waren die bei SuHx beobachteten pathogenen Veränderungen nach der Minipumpen-Verabreichung von CNP alle weitgehend rückgängig gemacht. Dies unterstützt die bei den ecCNP -/- Tieren beobachteten funktionellen Defizite, deutet aber auch darauf hin, dass die therapeutische Verabreichung von CNP wirksamer ist als die Wirkungen des endogenen Peptids; darüber hinaus, dass unter Krankheitsbedingungen eine ausreichende NPR-B/NPR-C-Expression vorhanden ist, um pharmakologisch anzugehen. Tatsächlich zeigen wir, dass die CNP-Behandlung die reduzierte Expression von NPR-B und NPR-C, die in der experimentellen PH beobachtet wurde, umkehrt und dadurch die pharmakologischen Effekte des Peptids verstärkt. Daher scheinen die positiven Effekte von CNP im SuHx-Mausmodell mit einer Verschiebung von einer pro-remodeling-fördernden Umgebung zu einem Zustand relativer Ruhe im Lungenkreislauf verbunden zu sein. Dennoch konnte diese Intervention die RV-Expression von TGF-β1 und Fibronektin nicht signifikant reduzieren.bei WT-Tieren, was eine einigermaßen gezielte therapeutische Wirkung auf die BMPR2/Smad-Signalgebung unterstützt. Ein alternativer Ansatz zur Steigerung der endogenen CNP-Werte ist die Blockierung des NEP-vermittelten Abbaus. Zahlreiche Daten deuten darauf hin, dass NEP-Inhibitoren oder Gendeletionen die Entwicklung einer hypoxischen PH abschwächen, indem sie die Aktivität endogener natriuretischer Peptide in experimentellen Krankheitsmodellen  [14]  [  53]  [ 54  ]  [55]  und bei PAH-Patienten  [15]  steigern , und könnten für den Einsatz von Angiotensin-Rezeptorblockern/NEP-Inhibitoren (z. B. Entresto) bei PH sprechen  [56]  . Außerdem haben wir und andere gezeigt, dass Medikamentenkombinationen, die die cGMP-abhängige Signalgebung verstärken, eine additive, wenn nicht synergistische therapeutische Aktivität im Rahmen von PH bieten  [14]  [  15]  [  24]  . Die hier gezeigten günstigen Wirkungen von CNP würden zu einem solchen Konzept passen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass auch NPR-C-abhängige Signalwege angesprochen werden. Eine Einschränkung der Generalisierbarkeit der Studie besteht jedoch darin, dass zwar Tiere beiderlei Geschlechts verwendet wurden, bei der Untersuchung jedoch keine besonderen geschlechtsspezifischen Unterschiede berücksichtigt wurden.Zusammenfassend liefert diese Studie überzeugende In-vitro- und In-vivo- Beweise für die schützende Wirkung der endogenen CNP-Signalgebung gegen PH und RV-Remodellierung und trägt dazu bei, Unklarheiten hinsichtlich der pharmakologischen Wirksamkeit von CNP bei dieser Erkrankung zu beseitigen  [9]  ,  [10]  ,  [11]  . Diese Ergebnisse legen nahe, dass CNP und seine nachgeschalteten Rezeptoren potenzielle krankheitsmodifizierende Ziele be